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专注多肽 服务科研
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背景
吗啡类似物存在于不同物种的大脑或垂体中。在这些肽主要结构的C端序列包含Beta-Lipotropin (beta-LPH)。
在人和猪的垂体及下丘脑神经垂体提取物中，在分离的片段序列和羧基终端部分之间的部分也观察到相应Beta-Lipotropins。
参考文献：
1. Bradbury, A.F., Smyth, D.G. and Snell, C.R. (1976), Biochem. Biophys. Res. Commun. 6!J, 950-956.
2. Ling, N., Burgus, R. and Guillemin, R. (1976). Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 73, 3942-3946.
内吗啡肽(Endomorphin)的定义
内吗啡肽（EM）-1和EM-2是位于中枢神经系统和免疫组织中的阿片样四肽，对μ-阿片受体1具有高度的选择性和亲和力【1】。
Endomorphin (EM)-1 and EM-2 are opioid tetrapeptides located in the central nervous system and immune tissues with high selectivity and affinity for the µ-opioid receptor 【1】.
内吗啡肽(Endomorphin)相关肽
阿片肽及其G蛋白偶联受体（δ、κ和μ受体）分布于中枢神经系统和外周组织。对阿片系统的研究旨在确定疼痛调节的内在机制，并开发出独特有效的疼痛控制物质，同时尽可能减少滥用潜力和副作用。存在两种类型的内源性阿片肽，一种含有色氨酸-甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸（Trp-Gly-Gly-Phe）作为信息域（脑啡肽、内啡肽、强啡肽），另一种含有酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸/色氨酸序列（内吗啡肽-1和-2）【2】。
Opioid peptides and their G-protein-coupled receptors (d, ? and µ) are located in the central nervous system and peripheral tissues. The opioid system has been studied to determine the intrinsic mechanism of modulation of pain and to develop uniquely effective pain-control substances with minimal abuse potential and side effects. Two types of endogenous opioid peptides exist, one containing Try-Gly-Gly-Phe as the message domain (enkephalins, endorphins, dynorphins) and the other containing the Tyr-Pro-Phe/Trp sequence (endomorphins-1 and -2) 【2】.
内吗啡肽(Endomorphin)的发现
1997年，Zadina等人从牛脑中分离出内吗啡肽1（EM1）和内吗啡肽2（EM2），并报道它们是迄今为止所描述的所有内源性物质中对μ受体具有最高特异性和亲和力的四肽【3】。
In 1997, Zadina et al., isolated Endomorphin 1 (EM1) and endomorphin 2 (EM2) from bovine brain, and reported them to be tetrapeptides having the highest specificity and affinity for the µ receptor of any endogenous substance so far described 【3】.
内吗啡肽(Endomorphin)的结构特征
含有内吗啡肽（EMs）信息域氨基酸序列Tyr-Pro-Phe/Trp的阿片样物质和阿片肽被发现具有独特的结合活性。内吗啡肽-1（Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2）和内吗啡肽-2（Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2）具有高度的μ受体亲和力和显著的选择性【2】。第三芳香环的正确空间取向和构象限制被认为是内吗啡肽与μ阿片受体（MOR）相互作用的关键【4】。
Opioidmimetics and opioid peptides containing the amino acid sequence of the message domain of endomorphins (EMs), Tyr-Pro-Phe/Trp, have been found to exhibit unique binding activity. Endomorphin-1 (Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2) and endomorphin-2 (Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2) have high µ receptor affinity and remarkable selectivity 【2】. The proper spatial orientation and conformational restriction of the third aromatic ring is supposed to be crucial for the interaction of EMs with MOR (µ opioid receptor) 【4】.
内吗啡肽(Endomorphin)作用方式
在迄今为止描述的所有内源性物质中，内啡肽对µ受体的特异性和亲和力最高。在体外实验中，EM1比µ选择性类似物DAMGO更有效，且在小鼠体内产生强效且持久的镇痛作用。EM2（H-Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2）对µ受体也具有高亲和力和高选择性【2】。µ阿片受体是G蛋白偶联受体，在临床上使用的阿片受体激动剂的镇痛作用中发挥着关键作用。内啡肽诱导的镇痛作用是通过脊髓µ阿片受体介导的【5】。
The endomorphins have the highest specificity and affinity to the µ receptor among all endogenous substance so far described. EM1 is more effective than the µ- selective analogue DAMGO in vitro and produces potent and prolonged analgesia in mice. EM2 (H-Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2) also has a high affinity and selectivity to the µ receptor 【2】. The µ-opioid receptors are G protein-coupled receptors that play a pivotal role in the analgesic effects of opioid receptor agonists used clinically. Endomorphin-induced antinociception is mediated by spinal µ-opioid receptors 【5】.
内吗啡肽(Endomorphin)的功能
内吗啡肽（Endomorphins）与多种生理功能有关，包括镇痛、心血管、呼吸、消化、奖赏和内分泌反应【5】。内吗啡肽1（EM1）和内吗啡肽2（EM2）具有显著的纳洛酮敏感性和血管舒张活性【6】。它们能调节小胶质细胞的吞噬作用、趋化作用和超氧阴离子产生【7】。基于内吗啡肽设计的类似物可能具有治疗潜力【8】。
Endomorphins have been implicated in a broad range of physiological functions including antinociceptive, cardiovascular, respiratory, digestive, rewarding, and endocrine responses 【5】 EM 1 and EM2 have significant naloxone-sensitive, vasodepressor activity 【6】. They modulate phagocytosis, chemotaxis and superoxide anion production by microglia 【7】. The analogues designed based on endomorphins may have therapeutic potential 【8】.
内吗啡肽(Endomorphin)的相关文献
1. Coventry TL, Jessop DS, Finn DP, Crabb MD, Kinoshita H, Harbuz MS (2001). Endomorphins and activation of the hypothalamo-pituitary-adrenal axis. J Endocrinol., 169(1):185-193.
2. Okada Y, Tsuda Y, Bryant SD, Lazarus LH (2002). Endomorphins and related opioid peptides. Vitam Horm., 65:257-279.
3. Zadina JE, Hackler L, Ge LJ, Kastin AJ (1997). A potent and selective endogenous agonist for the mu-opiate receptor. Nature, 386(6624):499–502
4. Yu Y, Shao X, Cui Y, Liu HM, Wang CL, Fan YZ, Liu J, Dong SL, Cui YX, Wang R (2007).Structure-activity study on the spatial arrangement of the third aromatic ring of endomorphins 1 and 2 using an atypical constrained C terminus. ChemMedChem., 2(3):309-317.
5. Xie H, Woods JH, Traynor JR, Ko MC (2008). The Spinal Antinociceptive Effects of Endomorphins in Rats: Behavioral and G Protein Functional Studies. Anesth Analg., 106(6):1873-1881.
6. Champion HC, Zadina JE, Kastin AJ, Hackler L, Ge LJ, Kadowitz PJ (1997).. The Endogenous Mu-Opioid Receptor Agonists Endomorphins 1 and 2 Have Novel Hypotensive Activity in the Rabbit. Biochemi Biophysl Res Commun., 235(3) 567-570
7. Azuma Y, Ohura K, Wang PL, Shinohara M (2001). Endomorphins 1 and 2 modulate chemotaxis, phagocytosis and superoxide anion production by microglia. J Neuroimmunol., 119(1):51-56.
8. Huo XF, Ren WH, Wu N, Wang R (1998).The design and synthesis of endomorphins and their analogues. Chinese Science Bulletin., 46(13):1096-1099.
多肽H2N-Glu-Leu-Ala-Gly-Ala-Pro-Pro-Glu-Pro-Ala-COOH的合成步骤：
1、合成CTC树脂：称取1.44g CTC Resin（如初始取代度约为0.35mmol/g）和0.6mmol Fmoc-Ala-OH于反应器中，加入适量DCM溶解氨基酸（需要注意，此时CTC树脂体积会增大好几倍，避免DCM溶液过少），再加入1.51mmol DIPEA（Mw：129.1,d：0.740g/ml），反应2-3小时后，可不抽滤溶液，直接加入1ml的HPLC级甲醇，封端半小时。依次用DMF洗涤2次，甲醇洗涤1次，DCM洗涤一次，甲醇洗涤一次，DCM洗涤一次，DMF洗涤2次（这里使用甲醇和DCM交替洗涤，是为了更好地去除其他溶质，有利于后续反应）。得到 Fmoc-Ala-CTC Resin。结构图如下：
2、脱Fmoc：加3倍树脂体积的20%Pip/DMF溶液，鼓氮气30分钟，然后2倍树脂体积的DMF 洗涤5次。得到 H2N-Ala-CTC Resin 。（此步骤脱除Fmoc基团，茚三酮检测为蓝色，Pip为哌啶）。结构图如下：
3、缩合：取1.51mmol Fmoc-Pro-OH 氨基酸，加入到上述树脂里，加适当DMF溶解氨基酸，再依次加入3.02mmol DIPEA，1.44mmol HBTU。反应30分钟后，取小样洗涤，茚三酮检测为无色。用2倍树脂体积的DMF 洗涤3次树脂。（洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备）。得到Fmoc-Pro-Ala-CTC Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：树脂=3：6：2.85：1（摩尔比）。结构图如下：
4、依次循环步骤二、步骤三，依次得到
H2N-Pro-Ala-CTC Resin
Fmoc-Glu(OtBu)-Pro-Ala-CTC Resin
H2N-Glu(OtBu)-Pro-Ala-CTC Resin
Fmoc-Pro-Glu(OtBu)-Pro-Ala-CTC Resin
H2N-Pro-Glu(OtBu)-Pro-Ala-CTC Resin
Fmoc-Pro-Pro-Glu(OtBu)-Pro-Ala-CTC Resin
H2N-Pro-Pro-Glu(OtBu)-Pro-Ala-CTC Resin
Fmoc-Ala-Pro-Pro-Glu(OtBu)-Pro-Ala-CTC Resin
H2N-Ala-Pro-Pro-Glu(OtBu)-Pro-Ala-CTC Resin
Fmoc-Gly-Ala-Pro-Pro-Glu(OtBu)-Pro-Ala-CTC Resin
H2N-Gly-Ala-Pro-Pro-Glu(OtBu)-Pro-Ala-CTC Resin
Fmoc-Ala-Gly-Ala-Pro-Pro-Glu(OtBu)-Pro-Ala-CTC Resin
H2N-Ala-Gly-Ala-Pro-Pro-Glu(OtBu)-Pro-Ala-CTC Resin
Fmoc-Leu-Ala-Gly-Ala-Pro-Pro-Glu(OtBu)-Pro-Ala-CTC Resin
H2N-Leu-Ala-Gly-Ala-Pro-Pro-Glu(OtBu)-Pro-Ala-CTC Resin
Fmoc-Glu(OtBu)-Leu-Ala-Gly-Ala-Pro-Pro-Glu(OtBu)-Pro-Ala-CTC Resin
以上中间结构，均可在专肽生物多肽计算器-多肽结构计算器中，一键画出。
最后再经过步骤二得到 H2N-Glu(OtBu)-Leu-Ala-Gly-Ala-Pro-Pro-Glu(OtBu)-Pro-Ala-CTC Resin，结构如下：
5、切割：6倍树脂体积的切割液（或每1g树脂加8ml左右的切割液），摇床摇晃 2小时，过滤掉树脂，用冰无水乙醚沉淀滤液，并用冰无水乙醚洗涤沉淀物3次，最后将沉淀物放真空干燥釜中，常温干燥24小试，得到粗品H2N-Glu-Leu-Ala-Gly-Ala-Pro-Pro-Glu-Pro-Ala-COOH。结构图见产品结构图。
切割液选择：1）TFA：H2O=95%：5%、TFA：H2O=97.5%：2.5%
2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%
3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%
（前两种适合没有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三种适合几乎所有的序列。）
6、纯化冻干：使用液相色谱纯化，收集目标峰液体，进行冻干，获得蓬松的粉末状固体多肽。不过这时要取小样复测下纯度 是否目标纯度。
7、最后总结：
杭州专肽生物技术有限公司（ALLPEPTIDE https://www.allpeptide.com）主营定制多肽合成业务，提供各类长肽，短肽，环肽，提供各类修饰肽，如：荧光标记修饰（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基团修饰肽（叠氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素标记肽（N15、C13），订书肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修饰肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修饰肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），环肽（酰胺键环肽、一对或者多对二硫键环），生物素标记肽，PEG修饰肽，甲基化修饰肽
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